Fire personer i aktivistgruppen, blant dem tre amerikanere, ble drept i flystyrten. Tiltalen blir sett på en eskalering av konflikten mellom Cuba og USA, skriver AP.
Blir Castro dømt kan han risikere dødsstraff, men det er uklart om han vil dukke opp i en amerikansk rettssal.
Fungerende statsadvokat Todd Blanche sier de forventer at han vil dukke opp.
– Enten ved egen vilje eller på en annen måte, sier han.
Han svarer ikke på om USA har planer om en militær aksjon på Cuba.
USAs president Donald Trump sier onsdag kveld norsk tid at tiltalen er et stort øyeblikk.
– Vi må hjelpe det cubanske folk. Det blir ingen eskalering på Cuba, sier han.
Cuba fordømmer
President på Cuba Miguel Díaz-Canel har fordømt tiltalen mot ekspresidenten.
Han kaller tiltalen «en politisk manøver, helt uten rettslig grunnlag», som kun har til mål å fabrikkere en sak for å rettferdiggjøre militæraggresjonen mot landet, skriver NTB.
Castro er tiltalt sammen med fem andre.
Den nå 94-år gamle Castro var forsvarsminister da flyet ble skutt ned.
Kan brukes som pressmiddel
Professor Benedicte Bull ved Senter for utvikling og miljø ved UiO sier USA gjør mye for å trappe opp presset mot de cubanske myndighetene.
– Men dette her tenker jeg også dreier seg om at de kommer til å prøve å få til en avtale. De som kommer til å være mest kritiske til det, er eksil -cubanske miljøer i USA og andre som overhodet ikke vil samarbeide, sier hun.
Hun mener det er tydelig at USA kjører knallhard for å få til en form for endring i landet.
– Så dette handler nok mye om både press og å håndtere eventuell innenlandsk opposisjon mot en mulig avtale som kan komme, sier hun.
Advarer om angrep fra USA
Tirsdag gikk Díaz-Canel ut og advarte om at et amerikansk angrep på øystaten vil utløse et «blodbad med ufattelige konsekvenser».
Uttalelsen kom etter at Axios har skrevet at Cuba har fått over 300 militære droner fra Russland og Iran, og vurderer å bruke dem mot amerikanske mål, skriver AFP.
Trump har innført en energiblokade mot øya, og har truet med militære handlinger siden amerikanske styrker pågrep Venezuelas president Nicolás Maduro i januar.
Blokaden har ført til at landet er gått tom for diesel og raffinert olje.